抗病毒药物筛选方法及其应用与流程

背景技术：

现有的抗病毒药物筛选系统是将病毒转录复制相关的基因和荧光素酶报告基因构建于真核表达载体上，然后共转染宿主细胞，再用荧光检测设备来检测药物对荧光强度的影响，从而筛选出有效的抗病毒药物。如抗埃博拉病毒药物筛选系统和抗流感病毒药物的筛选系统；还有针对病毒包膜的特定蛋白，涉及病毒的组织亲嗜性，比如针对流感病毒神经氨酸酶na的磁珠法筛选系统。

然而，现有筛选系统只能筛选出针对病毒感染某个阶段的抗病毒药物，比如装配阶段，而对于其他阶段如吸附，脱壳等，还需要设计其他的筛选系统；病毒通过基因工程加入报告基因后，会导致结构改变，并不能完全模拟活病毒的感染；针对不同病毒需要设计不同的病毒复制质粒或假病毒以及报告基因，且操作过程比较复杂。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种抗病毒药物筛选方法，该筛选方法操作简单，成本低，筛选通量大，完全模拟活病毒的感染过程，能够筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二个目的在于提供抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用，制备出新的抗病毒药物用于治疗因病毒感染而导致的疾病。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；

然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。

作为进一步技术方案，所述病毒为具有完全感染能力的活病毒；

优选地，所述病毒包括动物病毒；

优选地，所述动物病毒包括肠道病毒、疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒中的至少一种；

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生5～25个空斑；

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生10～20个空斑；

优选地，所述病毒吸附的时间为0.8～1.2h，优选为1h。

作为进一步技术方案，所述细胞包括动物细胞；

优选地，所述动物细胞包括肠上皮细胞、羊膜细胞和成纤维细胞中的至少一种。

作为进一步技术方案，所述培养基包括微晶纤维素；

优选地，微晶纤维素在培养基中的浓度为0.3％～1.5％，优选为1.2％。

作为进一步技术方案，所述待筛选药物的浓度为50～1000μm，优选为50～150μm；

优选地，所述待筛选药物的加入量为0.8％～1.2％(v/v)，优选为1％(v/v)。

作为进一步技术方案，所述固定所用到的固定液包括中性甲醛固定液、乙醇固定液和多聚甲醛固定液中的至少一种，优选为中性甲醛固定液；

优选地，中性甲醛固定液的浓度为4％～10％，优选为8％；

优选地，中性甲醇固定液的加入量为80％～120％(v/v)，优选为100％(v/v)；

优选地，中性甲醛固定液的固定时间为0.8～1.2h，优选为1h。

作为进一步技术方案，所述染色包括中性红染色、结晶紫染色和苏木精-伊红染色，优选为中性红染色；

优选地，中性红溶液的浓度为0.1％～1.5％，优选为0.3％。

作为进一步技术方案，所述染色后还包括清洗和晾干的步骤。

作为进一步技术方案，所述单层细胞的培养皿包括6孔、12孔、24孔、48孔和96孔培养板，优选为96孔培养板；

优选地，96孔培养板上每种药物设2～4个复孔；

优选地，96孔培养板上不加药物的对照孔至少为3个。

第二方面，本发明提供了一种抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。